1.0目標(biāo)

制定程序就是為生物指標(biāo)的鑒定提供指導(dǎo)。

2.0范圍

此程序適用于生物指示劑的鑒定，即硬脂酸地芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）ATCC 7953和萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）（枯草芽孢桿菌）ATCC 9372，用于高壓滅菌和隧道驗(yàn)證。

3.0責(zé)任

微生物學(xué)家

4.0問責(zé)制

質(zhì)量檢查和質(zhì)量控制主管

5.0程序

5.1生物指示劑培養(yǎng)物鑒定試驗(yàn)

5.1.1顯微鏡檢查–將一塊生物指示劑或安瓿懸于  10 ml無菌生理鹽水中。輕輕搖晃懸浮液并將一圈懸浮液轉(zhuǎn)移到載玻片上。進(jìn)行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察載玻片。亞末端溶脹的細(xì)胞中具有橢圓形內(nèi)生孢子的革蘭氏陽性棒表明嗜熱脂肪地芽孢桿菌的身份。萎縮芽孢桿菌為革蘭氏陽性，呈橢圓形和中心內(nèi)生孢子狀，細(xì)胞未腫脹。

5.1.2增長(zhǎng)特征

5.1.2.1將一塊生物指示劑（一個(gè)安瓿瓶）懸浮在10 ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中，并在37ºC下孵育48小時(shí)。從試管中在每?jī)蓚€(gè)含大豆酪蛋白消化瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中劃線一圈。在30ºC至35ºC的溫度下培養(yǎng)一個(gè)Petridish，在55ºC至60ºC的溫度下培養(yǎng)24小時(shí)。
5.1.2.2如果在55ºC至60ºC的溫度下培養(yǎng)的板顯示出微生物生長(zhǎng)的跡象，而在30ºC至35ºC的溫度下培養(yǎng)的板未顯示出微生物生長(zhǎng)的跡象，則表明嗜熱性地芽孢桿菌的身份。
5.1.2.3如果在30ºC至35ºC的溫度下培養(yǎng)的平板顯示出微生物生長(zhǎng)的跡象，而在55ºC至60ºC的溫度下培養(yǎng)的平板沒有任何微生物生長(zhǎng)的跡象，則表明存在萎縮芽孢桿菌。

5.2生物指標(biāo)中總活菌計(jì)數(shù)

5.2.1從原始的單個(gè)容器中隨機(jī)選擇四根生物指示劑的孢子條。
5.2.2將每個(gè)孢子條放入帶有三個(gè)6 mm玻璃珠和5.0 ml 無菌純凈水的無菌，帶螺帽的平底管中。
5.2.3渦旋4到7分鐘，直到紙架浸入紙漿。
5.2.4加入5.0毫升無菌純凈水。再次渦旋。
5.2.5將1 ml懸浮液轉(zhuǎn)移到裝有9 ml無菌純凈水和渦旋的試管中。
5.2.6將稀釋管在95ºC–100ºC的預(yù)熱浴中放置15±1分鐘，以用于嗜熱地?zé)嵫挎邨U菌和萎縮芽孢桿菌80ºC至85ºC。
5.2.7拆下試管，并在冰浴（0ºC–4ºC）中迅速冷卻。
5.2.8將每個(gè)熱沖擊管渦旋至少十秒鐘。現(xiàn)在，連續(xù)稀釋這些試管以產(chǎn)生30到300個(gè)菌落。將每個(gè)稀釋管渦旋至少十秒鐘。
5.2.9為每個(gè)等分試樣準(zhǔn)備單獨(dú)的一系列板。將1.0毫升每種選定的稀釋液分別放入兩個(gè)培養(yǎng)皿中。
5.2.10將約20毫升融化的大豆酪蛋白消化瓊脂倒入培養(yǎng)皿，冷卻至45º至50ºC。旋轉(zhuǎn)以確保充分混合并使瓊脂凝固。
5.2.11將嗜熱嗜熱地芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌30ºC–35ºC在55º–60ºC的平板上顛倒并孵育48至72小時(shí)。可將在55ºC至60ºC的溫度下孵育的設(shè)備放置在塑料袋中，以防止平板過度干燥。
5.2.12孵育后計(jì)數(shù)CFU。
5.2.13平均計(jì)數(shù)，然后乘以稀釋因子，以計(jì)算每個(gè)原始單位的人口。
5.2.14將所有信息記錄在生物學(xué)指標(biāo)的人口確定記錄中。
5.2.15對(duì)于生物指示劑，密封的安瓿瓶，在無菌的250 ml錐形燒瓶中取4安瓿瓶，并通過搖晃燒瓶側(cè)面打破安瓿瓶。加入足量的無菌純凈水以制成100毫升＆渦旋或劇烈聲處理以獲得均勻的懸浮液。轉(zhuǎn)移10毫升至無菌螺旋蓋管中。執(zhí)行上述步驟。

5.3孢子存活時(shí)間和殺死時(shí)間測(cè)試

對(duì)于嗜熱地?zé)嵫挎邨U菌
5.3.1為了存活時(shí)間，將一個(gè)生物指示劑放在一個(gè)合適的容器中，如培養(yǎng)皿的蓋子，并將其放置在事先合格的高壓滅菌器中。不要關(guān)閉培養(yǎng)皿，以使生物指示劑完全暴露在蒸汽中。根據(jù)生物指示劑分析證書，在121°C（±0.5ºC）的溫度下運(yùn)行蒸汽滅菌循環(huán)，以縮短生存時(shí)間。立即從高壓滅菌器中卸下生物指示劑，并無菌轉(zhuǎn)移到無菌SCDM中，然后將生物指示劑在55°C至60°C下孵育7天。
5.3.2為了消滅時(shí)間，將一個(gè)生物指示劑放在合適的容器中，如培養(yǎng)皿的蓋子，然后將其放在事先合格的高壓滅菌器中。不要關(guān)閉培養(yǎng)皿，以使生物指示劑完全暴露在蒸汽中。根據(jù)生物指示劑分析證書，在121°C（±0.5ºC）的溫度下運(yùn)行蒸汽滅菌循環(huán)，以達(dá)到zui小殺滅時(shí)間。立即從高壓滅菌器中卸下生物指示劑，并無菌轉(zhuǎn)移到無菌SCDM中，然后將生物指示劑在55°C至60°C下孵育7天。
5.3.3還要應(yīng)用陽性和陰性對(duì)照。
5.3.4存活時(shí)間測(cè)試和陽性對(duì)照中應(yīng)該有明顯的增長(zhǎng)，而殺滅時(shí)間測(cè)試和陰性對(duì)照中沒有明顯的增長(zhǎng)。
對(duì)于萎縮芽孢桿菌
5.3.5對(duì)于存活時(shí)間，將一個(gè)生物指示劑放在合適的容器中，如培養(yǎng)皿的蓋子，然后將其置于事先合格的DHS中。請(qǐng)勿關(guān)閉培養(yǎng)皿，以使生物指示劑完全暴露于干熱中。根據(jù)生物指標(biāo)分析證書，在160°C（±1ºC）的溫度下運(yùn)行DHS循環(huán)，以縮短生存時(shí)間。立即從DHS中卸下生物指示劑，并無菌轉(zhuǎn)移到無菌SCDM中，然后將生物指示劑在30°C至35°C下孵育7天。
5.3.6為了消滅時(shí)間，將一個(gè)生物指示劑放在適當(dāng)?shù)娜萜髦校缗囵B(yǎng)皿的蓋子，然后將其放置在事先合格的DHS中。請(qǐng)勿關(guān)閉培養(yǎng)皿，以使生物指示劑完全暴露于干熱中。根據(jù)生物指示劑分析證書，在160°C（±1ºC）的溫度下運(yùn)行DHS循環(huán)，以達(dá)到zui小滅活時(shí)間。立即從DHS中卸下生物指示劑，并無菌轉(zhuǎn)移到無菌SCDM中，然后將生物指示劑在30°C至35°C下孵育7天。
5.3.7還要應(yīng)用正面和負(fù)面的控制。
5.3.8存活時(shí)間測(cè)試和陽性對(duì)照中應(yīng)該有明顯的增長(zhǎng)，而殺滅時(shí)間測(cè)試和陰性對(duì)照中沒有明顯的增長(zhǎng)。

5.4注意事項(xiàng)

5.4.1請(qǐng)勿使用已融化并保存超過8小時(shí)的瓊脂。
5.4.2為避免不準(zhǔn)確的板數(shù)，使用2.0 ml移液器或孔徑較大的移液器進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移非常重要。這將有助于避免棉纖維堵塞移液器吸頭。

5.5極限/驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)

如果每個(gè)載體的活孢子的對(duì)數(shù)平均數(shù)不小于0.3 log，且不超過每個(gè)載體的對(duì)數(shù)標(biāo)記的孢子數(shù)對(duì)總活菌數(shù)的0.48，則滿足測(cè)試要求。
相關(guān)：新的基因工程生物學(xué)指標(biāo)

6.0縮寫

SOP：標(biāo)準(zhǔn)操作程序
QA：質(zhì)量保證
QC：質(zhì)量控制
NA：不適用
SCDA：大豆酪蛋白消化瓊脂
IPA：異丙醇
CFU：菌落形成單位